Методы исследования крови

КровьКлассические и современные методы исследования крови

Кровь, выполняя в организме важнейшие метаболические функции (дыхания, питания и экскреции), одновременно является носителем информации, что позволяет ей понуждать организм при необходимости включать свои адаптационные резервы, корректирующие его жизнедеятельность, в том числе защиту и реабилитацию органов, систем и организма в целом.

Разумеется, это свойство крови немедленно отражается как на всем гемопоэзе, так и на морфологических особенностях клеток периферического кровотока. Именно эти реактивные состояния последнего служат объектом изучения и диагностики болезней при лабораторных ее исследованиях, поскольку отражают ту или иную патологию организма как целостной живой системы.

В настоящее время в клинической лабораторной диагностике используются две группы методов анализа клеток крови: 

а) микроскопический подсчет клеток в специально окрашенном на предметном стекле мазке капли крови, взятой из пальца, («классический» метод). В основе этого метода лежит способность ядер, рибосом и других органелл цитоплазмы клеток крови реагировать с некоторыми красителями, вследствие чего образуются преципитаты, позволяющие оценивать их структуру. Так, унифицированным методом оценки ретикулоцитов, является суправитальная (т.е. без предварительной фиксации клеток) окраска мазков бриллиантовым крезоловым синим, азуром 1 или 2 (в пробирке или на предметном стекле);

б) автоматизированные методы анализа и подсчета клеток, включающие компьютерный анализ изображения и проточную цитометрию. Такие методы позволяют стандартизировать предыдущий классический метод визуального анализа, что существенно повышает точность получаемых результатов.

Метод проточной цитометрии

Основан на окрашивании РНК клеток флюоресцентными красителями (акридином оранжевым, пиронином, тиофлавином Т, тизоловым оранжевым, этидиумом бромидом и некоторыми другими) – с последующей детекцией излучения. Использование метода проточной цитометрии (ПЦМ) позволяет не только определить количество клеток (например, ретикулоцитов), но и оценить степень их зрелости по количеству содержащейся в клетках РНК.

Современные проточные системы получили развитие с середины 50-х гг. прошлого столетия, после того, как W. Countler в 1956 г. сконструировал прибор для автоматического подсчета и анализа клеток крови. Работа этого прибора обеспечивалась им же ранее запатентованным кондуктометрическим методом, улучшенным затем гидродинамической фокусировкой, позволяющей осуществлять выстраивание клеток по центру проточного канала – за счет разницы давлений между потоком клеточных суспензий и обтекающим их раствором. Впоследствии были разработаны электронные счетчики клеток, основывающиеся на радиочастотных измерениях.

Приборы, позволяющие применять оптические принципы регистрации сигналов (поглощение, рассеивание света и флюоресценцию), описаны впервые в середине 60-х гг. XX в., хотя возможность применения этого метода изучалась значительно раньше, но регистрация данных не отличалась достаточной чувствительностью.

В 1965 г. был реализован принцип проточной сортировки клеток, которые было возможно анализировать в потоке, разбитом на мелкие капли. Последние несли на своей поверхности заряд, позволяющий электростатически сортировать их по разным пробиркам. Метод электростатического отклонения основывался на предварительной разработке системы регистрации для высокоскоростных струйных, пишущих чернилами осциллографов.

В настоящее время ПЦМ достаточно широко применяется в медицинских и биологических исследованиях. Развитие технического оснащения и методов метки клеток открыло уникальные возможности для измерения множества разнообразных клеточных параметров, что знаменует получение новых знаний о внутриклеточных процессах, обеспечивающих их функционирование.

В гематологии проточные системы используют для быстрого автоматического счета форменных элементов крови; дифференциального анализа, включающего подсчет формулы крови и выделение атипичных клеток, их фенотипирование с применением моноклональных антител; изучения клеточного цикла и выявления анеуплоидных клеточных клонов.

Далее рассматриваются: основы метода проточной цитометрии, принципы измерения параметров клеток; и приборы, используемые для цитометрического анализа, используемые в гематологии.

Основы метода проточной цитометрии

Принцип ПЦМ основан на быстром (30 м/с) пропускании суспензии клеток через зону чувствительности прибора. Концентрацию клеток подбирают с таким расчетом, чтобы скорость регистрации была достаточной (обычно 1000 клеток/с), но чтобы при этом в зоне детекции не было одновременно двух объектов. Сигналы от детекторов регистрируют в импульсной форме при помощи счетчиков, анализаторов импульсов или компьютеров (после оцифровывания).

При анализе определенного (обычно не менее 10000) количества объектов информацию накапливают и представляют в виде частотной гистограммы распределения. Последнюю составляют посредством установки шкалы интенсивности по оси абсцисс (эквивалентно значениям измерения параметра каждой клетки); по оси ординат обозначают количество клеток с данным значением измеряемого параметра).

Каждой клетке в пределах выбранной шкалы присваивают определенное место. Общую информацию об измеряемом параметре в определенной популяции хранят в виде гистограммы при накоплении индивидуальных данных.

В том случае, если анализу подлежат 2 параметра, данные представляют в виде графика в двухмерной системе координат. Когда с первыми двумя параметрами сопоставляется 3-й, появляется возможность получения информации по 3 показателям: в этом случае требуется компьютерная обработка данных – для сопоставления трех параметров на плоскости экрана монитора. Однако намного предпочтительнее оказалось представлять данные в виде нескольких одно- или двухмерных изображений.

Принцип регистрации оптических сигналов при ПЦМ базируется на пропускании объектов через специальную проточную камеру, в которой клетки поочередно пронизывает сфокусированный луч света. Поглощение и рассеивание света клеткой, а также флюоресценция связанных с ней красителей регистрируются светочувствительными датчиками – фотодиодами и фотоэлектронными умножителями.

Источниками света и возбудителями флюоресценции обычно являются газовые лазеры или ртутные дуговые лампы. В самом простом варианте проточного цитофлюорометра используется аргоновый лазер с длиной волны возбуждения 488 нм, а сигналы регистрируются по четырем параметрам: прямое светорассеивание (под углом 0,5-2,0°), угловое светорассеивание (под углом 90°), зеленая и красно-оранжевая флюоресценции. Более современные приборы («Epices-XL», «FACS Calibur») могут регистрировать одновременно флюоресценцию при четырех длинах волн, прямом и угловом рассеивании света.

Методы измерения клеток

Кондуктометрия является наиболее распространенным способом проточного анализа клеток крови и широко применяется при осуществлении рутинных исследований в гематологических лабораториях, а также на некоторых исследовательских моделях многопараметровых установок, предназначенных для анализа и сортировки клеток. Метод кондуктометрии используется в большинстве гематологических анализаторов, осуществляющих дифференциальный подсчет формулы крови.

Кондуктометрический детектор представляет собой капилляр диаметром порядка 70 мкм и длиной, составляющей 0,75 диаметра, через который с большой скоростью пропускается суспензия клеток, находящихся в растворе электролита.

По обе стороны от капилляра (апертуры) находятся электроды, между которыми поддерживается постоянный ток. Поскольку электрическое сопротивление клетки значительно превышает аналогичное сопротивление электролита, в момент прохождения клетки через апертуру ее электрическое сопротивление резко возрастает.

Амплитуда объема вытесненного электролита отражает объем клетки. Подсчет количества объектов в единице объема пробы позволяет проанализировать их концентрацию.

Более детальный анализ заключается в изучении распределения клеток по объему. Радиочастотный анализ является разновидностью кондуктометрического метода и применяется на некоторых гематологических анализаторах.

При прохождении апертуры объектом в токе высокой частоты также возникают сигналы, амплитуда которых зависит от размеров ядра (его ядерного матрикса) и цитоплазматических включений. Эти сигналы в значительной степени отражают характер внутренней структуры клеток.

Регистрация светорассеивания и светопоглощения

Физический анализ светорассеивания частиц клеток достаточно сложен и нуждается в детальном осмыслении. Светорассеивание обусловлено размерами клеток, их формой, плотностью, окрашиванием и гранулярностью внутриклеточных структур.

Рассеянный свет от клеток и частиц включает дифракционные, рефракционные и отражающие составляющие. Светорассеивание, применяемое для характеристики клеток, измеряется по-разному.

При малых углах относительно оси падающего света преобладает дифракция. Рассеивание вблизи первого минимума переднего светового дифракционного изображения используют для измерения размера объектов.

С возрастанием угла рассеивания увеличивается значение рефракционных эффектов. Поскольку рефракционные лучи пересекают содержимое клетки, регистрируемые при этом сигналы в большей степени отражают внутриклеточную микроструктуру.

Преломление света зависит от поглощения, и это обстоятельство может быть использовано для измерения способности клеток окрашиваться поглощающими красителями. Ослабление осевого пучка света (поглощение) также используется для проточного анализа. В частности, этот метод применяется в гематологических анализаторах «Tehnicon», США, и в приборах фирмы Roche, Швейцария, – для дифференциального подсчета лейкоцитов периферической крови.

Флюориметрия

В основе этого метода лежит измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами (что является определяющим в ПЦМ). Флюоресценция имеет три преимущества в исследованиях ПЦМ:

– флюоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам;

– очень низкая концентрация красителя, применяемого для исследования клеток;

– нефлюоресцирующие соединения могут становиться флюоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами.

В цитофлюориметрии наиболее часто используют методики анализа распределения клеток по содержанию ДНК и флюоресцентную метку клеток антителами (иммунофенотипирование), которые можно применять на одном образце.

Интенсивность флюоресцентного сигнала и, следовательно, качество измерений зависят от различных инструментальных характеристик: интенсивности возбуждающего света, скорости движения объектов в потоке, спектра возбуждения красителя, его квантовой эффективности, собирающей и передающей эффективности световой оптики, а также чувствительности фотоэлектронных умножителей.

Изучение поляризации флюоресценции позволяет охарактеризовать такое важное функциональное состояние клеток, каким является вязкость или текучесть клеточных мембран.

При поляризации лазерного свечения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. В том случае, если молекулы заметно вращаются, их ориентация меняется до начала флюоресценции, и интенсивность поляризованного света уменьшается.

Поляризация светорассеивания используется в специальной технологии MAPS (поляризация многоуглового светорассеивания), используемой в гематологических анализаторах фирмы Abbott для дифференцировки эозинофилов и базофилов.

Анализ сигнала волновой формы применяется для измерения ядерного и цитоплазматического соотношения. Для этого используют «щелевой» анализ: лазерный луч фокусируют до диаметра 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью.

Регистрируемые флюоресцентные сигналы имеют волновую форму, которая отражает структуру и размеры объекта вдоль оси, перпендикулярной щели. Такую методику применяли для анализа структуры хромосом млекопитающих.

Аппаратура для проточной цитометрии

Аппаратура для ПЦМ постоянно усовершенствуется: разработки имеют тенденцию создания более удобных для использования приборов, специализированных и автоматизированных систем, позволяющих повысить скорость и точность анализов и не требующих от обслуживающего персонала высокой квалификации.

Высокий технический уровень оборудования для ПЦМ уже достигнут, и дальнейшее развитие этого направления идет по пути разработки новых методов флюоресцентной метки биологических объектов, создания более специфичных и чувствительных зондов, усовершенствования методик фиксации и окраски клеток.

В настоящее время большую часть приборов для ПЦМ производят две крупные фирмы: Becton Dickinson и Coulter. Все выпускаемые этими фирмами приборы имеют близкие параметры, отвечающие трем уровням систем, имеющим различные области применения.

Оборудование 1-го уровня – это наименее дорогие приборы, оснащенные относительно слабым источником света (обычно аргоновым лазером с воздушным охлаждением). Эти приборы предназначаются для повседневных исследований и применяются в диагностических лабораториях при клинических медицинских центрах и крупных больницах.

Оборудование 2-го уровня представляет собой полностью автоматизированные приборы с лазерным источником света и возможностью сортировки клеток. Такие цитометры могут применяться в исследовательских целях. Ими оснащают большие научные центры.

Оборудование 3-го уровня – наиболее дорогие приборы, позволяющие контролировать и изменять все основные стадии управления, что дает возможность приспосабливать их к решению новых исследовательских задач. Аппаратура неудобна для применения в повседневных условиях, занимает много места и требует высокой квалификации обслуживающего персонала и ремонтной базы.

На приборах, производимых европейскими фирмами, в качестве источника света обычно используют ртутные или ксеноновые дуговые лампы, что значительно снижает стоимость оборудования. В России производителем проточных цитофлюориметров является фирма «Медимакс».

В настоящее время в клинической гематологии наиболее широкое применение получили два метода цитофлюориметрического анализа: ДНК-цитометрия и изучение метки клеток поверхностными маркерами. Другие методики или не получили распространения, находясь на стадии разработки, или оказались слишком сложными и недостаточно информативными для повсеместной гематологической практики.

Тем не менее, изучение распределения клеток по содержанию ДНК позволяет анализировать стадии клеточного цикла и наличие анеушюидных (отличающихся от нормы) опухолевых клонов. Нарушения клеточного цикла гемопоэтических клеток наблюдается при действии на организм ионизирующей радиации и цитостатических агентов, а также при ряде гематологических заболеваний.

Анеуплоидное содержание ДНК наблюдается более чем в 20 % случаев острого лейкоза (при остром лимфобластном лейкозе детей – в 39% случаев) и в 70% случаев рака. Применение ПЦМ позволяет выявить не только анеуплоидный клеточный клон, но и пролифератив- ную активность злокачественных клеток.

ПЦМ помогает выявлять распределение клеточных антигенов даже в тех случаях, когда это не удается сделать с помощью световой микроскопии, и делает это более быстро и точно. Количество клеточных маркеров, позволяющих осуществлять иммунофенотипирование, постоянно увеличивается (их уже более 100), что позволяет расширить область использования ПЦМ.

К недостаткам ПЦМ, наряду с высокой стоимостью аппаратуры, можно отнести отсутствие возможности прямого наблюдения (визуализации) изучаемых объектов. Однако это обстоятельство компенсируется большим количеством изучаемых клеток. Более того, объекты, представляющие интерес, могут быть сепарированы и в дальнейшем изучены другими методами, в том числе посредством световой микроскопии.

К кругу задач, которые могут быть решены с помощью ПЦМ более эффективно, чем при простой микроскопии, относятся: 1) анализ клеток, редко встречающихся в популяции; 2) количественная оценка экспрессии антигена; 3) выявление клеток, несущих 2 иммунологических маркера и более; 4) оценка экспрессии антигена на поверхности клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла.

Перечисленное свидетельствует о значительных потенциальных возможностях ПЦМ. Ибо, в отличие от большинства методик, применяемых в цитологии, ПЦМ позволяет минимизировать влияние процесса исследования на жизнеспособность и жизнедеятельность объекта, сохраняя стерильность и специальные требования к клеточной среде, а также осуществлять анализ динамики клеточных процессов, сохраняя при этом высокое временное разрешение.

Гематологические анализаторы

В клинических лабораториях большое распространение получили приборы для быстрого автоматического счета и анализа форменных элементов крови. В своем большинстве это относительно недорогие и простые в эксплуатации приборы, позволяющие производить рутинные исследования, связанные с подсчетом количества и определением размеров клеток периферической крови. Эти приборы производят фирмы, специализирующиеся на лабораторном медицинском оборудовании: Abbott, Analyse Instrument АВ, Coulter, Medicor, Roch, Serono, Sysmex и др.

Гематологические анализаторы – это специализированные и автоматизированные приборы с компьютерной обработкой сигналов, дающие оценку данных по 26 и более показателям в сочетании с графическим представлением основных клеточных популяций. Отличительными свойствами этой аппаратуры являются:

– автоматическое взятие и развитие пробы крови, которое может осуществляться из открытых или закрытых пробирок (через прокол в резиновой пробке);

– использование в большинстве приборов методов предварительной обработки пробы, которая может заключаться в цитохимической окраске и дифференциальном лизисе клеток;

– использование нескольких каналов для детекции сигналов. Эта технология может включать кондуктометрическое измерение объема (DS), радиочастотный анализ (RF), регистрацию поглощения и рассеивания света, а также поляризацию светорассеивания;

– использование специальных компьютерных алгоритмов для подсчета клеток и предоставления конечных результатов.

Так, гематологический анализатор «Cobas Vega» (фирма Roche, Швейцария) позволяет анализировать 22 гематологических параметра, а также процентное содержание и абсолютный подсчет двух патологических клеточных популяций: атипичных лимфоцитов и больших незрелых клеток. Измеряемые показатели включают:

– общее содержание лейкоцитов, процентное и абсолютное содержание лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов (11 показателей);

– содержание эритроцитов, гемоглобина, гематокрит, средний корпускулярный объем эритроцита, ширину распределения эритроцитов по объему, среднее содержание гемоглобина в эритроците (7 показателей);

– содержание тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, ширину распределения тромбоцитов по объему, тромбокрит (4 показателя).

Предусмотрено 2 метода взятия пробы: автоматический (закрытые пробирки, объем пробы 250 мкл, производительность 120 анализов в час) и ручной (закрытые пробирки, объем пробы 125 мкл, производительность 60 анализов в час).

В приборе предусмотрено 4 канала для детекции сигналов, 2 канала работают с применением кондуктометрического принципа измерения объема лейкоцитов. Отдельный канал служит для регистрации содержания базофилов: здесь также используется кондуктометрический способ измерения объема. Предварительная обработка пробы включает дифференциальный лизис клеток.

Для подсчета популяций лейкоцитов (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов) служит специальный канал, в котором для детекции сигналов применяется двухпараметровый анализ, включающий кондуктометрическое измерение объема и регистрацию поглощения света.

Дифференциальный подсчет достаточно сложен и основан на специальной технологии, которая заключается в предварительной обработке пробы специальным реагентом (хлоризол черный), выполняющим дифференциальную окраску лейкоцитов и цитохимическую окраску эозинофильных гранул. Затем пробу пропускают через специальную проточную камеру с двойной гидродинамической фокусировкой потока, где от каждой клетки регистрируется 2 параметра – объем и содержание эозинофильных гранул.

Результаты двухпараметрового ПЦМ-анализа представляются в виде точечной гистограммы распределения: каждой клетке присваивается определенное место (дот-плот-распределение). Анализ гистограммы с помощью специальных алгоритмов позволяет — наряду с дифференциацией четырех популяций (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы) – выделять атипичные лимфоциты и большие незрелые клетки. Подсчет базофилов производится посредством отдельного канала.

Оценивая точность гематологических анализаторов, следует отметить, что большое количество работ посвящено сопоставлению результатов дифференциального подсчета лейкоцитов ручным и различными автоматическими методами. В большинстве случаев продемонстрирована очень хорошая корреляция полученных данных в отношении нейтрофилов и лимфоцитов; несколько менее впечатляют результаты, полученные при оценке моноцитов, эозинофилов и базофилов.

Точность анализов при ручном методе счета значительно уступает автоматическому: например, содержание моноцитов, равное 10 %, подсчитанное при анализе 100 клеток в световом микроскопе, при автоматическом подсчете колеблется между 4,9 до 17,6% (при 95% доверительном интервале). Тот же показатель, полученный при ПЦМ-анализе 10 000 клеток, соответствует содержанию моноцитов от 9,4 до 10,7 %.

Таким образом, разработка приборов для ПЦМ знаменовала развитие нового этапа в современной гематологической диагностике и позволила не только поднять производительность лабораторий, но и в значительной степени повысить точность исследований, и более того, появилась возможность анализировать качественно новые информационные параметры клеток крови.

К автоматическим (компьютеризованным) анализаторам относится прибор «АСПЕК», разработанный и созданный совместно РТИ и ГНЦ, способный анализировать клеточный состав периферической крови по мазку, взятому из определенного объема ее пробы. В режиме автоматической микроскопии прибор осуществляет: сканирование препарата по заданной траектории; автоматическую фокусировку; ввод серии изображений полей зрения микроскопа (кадров) видеокамерой; компьютерную обработку этих изображений. Последняя базируется на схеме: исходный кадр «сегментируется», на нем выделяются связанные области, среди которых с помощью алгоритмов распознавания идентифицируются клетки крови.

Сегментация позволяет: выделить базовые элементы изображения; идентифицировать участки, соответствующие клеткам, фону, артефактам; учитывать внутриклеточные структуры – для полного описания объекта при подсчете лейкоцитарной формулы.

Алгоритм сегментации не требует информации о законах распределения и количестве сегментируемых областей. В этой связи они устойчивы к естественной вариабельности объектов, изменению интенсивности и условий окрашивания препаратов, а также условий съемки кадров. В приборе использована модель одинаково распределенных, независимых гауссовских пикселов.

Это сделано для ускорения и упрощения вычислений; и тем не менее для морфометрического анализа допускаются и более сложные модели анализа изображений. Подсчет форменных элементов осуществляется покадрово; и если кадр содержит участки, идентифицируемые как лейкоциты, то эти участки сегментируются повторно для детекции внутриклеточных структур. Вслед за этим последние опознаются как ядра и участки цитоплазмы, которые измеряются. Основываясь на этих описаниях, с помощью поэтапной процедуры распознавания выводится лейкоцитарная формула.

Алгоритмы распознавания в приборе «АСПЕК» должны обеспечивать быстродействие. Для этого используются алгоритмы двух этапов:

а) первичный этап распознавания, – это построение простого и быстрого алгоритма распознавания, основанного на априорной информации о клетках крови в мазке: их идентификация (эритроциты, тромбоциты, лейкоциты) и подсчет их количества в кадре и на всей площади мазка;

б) вторичный этап распознавания, – это подсчет лейкоцитарной формулы. При этом используется классическая статистическая многоэтапная процедура классификации. Описание объекта при этой процедуре значительно богаче, количество классов существенно больше и может увеличиваться в процессе эксплуатации прибора.

С целью оптимизации процедуры классификации априорную информацию разбивают на несколько этапов и каждый этап анализируют отдельно. Данная процедура имеет методическое сходство с «древовидными» процедурами, подразумевающими расширение количества распознаваемых классов, и одновременно отличается быстродействием и устойчивостью к вариабельности объектов.

На каждом этапе классификации изображений лейкоцитов последние объединяются по группам признаков в промежуточные классы. Классифицированные таким образом клетки «переносятся» на следующие этапы, где классификация уточняется с использованием следующего набора признаков.

Примерами промежуточных классов могут служить изображения многоядерных клеток, имеющих ядро правильной формы и другие особенности. Преимуществами предлагаемого алгоритма являются минимизация количества используемых признаков без потери качества анализа; возможность модификации процедуры посредством изменения количества этапов и блоков цитологических признаков; простая программная реализация процедуры и возможность ее модификации без дополнительного программирования.

Определение концентрации НЬ на приборе «АСПЕК» осуществляется измерением интегральной оптической плотности, площади поперечного сечения и такого показателя, каким является форма НЬ- содержащих клеток в неокрашенных препаратах. Всю информацию прибор «АСПЕК» собирает с мазка периферической крови, сканируя его по заданной траектории и учитывая распределение клеток по его площади.

При разработке систем анализа клеточного изображения особое значение придавалось автоматической обработке пробы и получению клеточного монослоя, иными словами – стандартизации подготовки анализируемой пробы.

Для этого прибор комплектуется запатентованными устройствами механизации и автоматизации подготовки пробы к анализу, причем такому, при котором все клетки в препарате лежат раздельно, сохраняя свою геометрию, структуру, текстуру, оптическую плотность, цвет, яркость и тинкториальные свойства: эритроциты – круглые безъядерные клетки розового цвета с центральным просветлением – пеллором; нейтрофилы – клетки с сегментированным ядром и плотной зернистой цитоплазмой; лимфоциты и моноциты – мононуклеарные клетки, отличающиеся размерами и плотностью ядра и цитоплазмы; тромбоциты – небольшие, морфологически неоднородные клетки.

Все необходимое для подготовки препаратов устройства поставляется с прибором. Таким образом, анализатор изображения «АСПЕК» может быть использован в клинической практике.

Однако, безусловно, он уступает проточным счетчикам в быстродействии, но при этом обладает рядом преимуществ: он способен распознавать большое количество типов клеток; он «обучаем»: в процессе работы увеличивается количество распознаваемых типов клеток; весьма важное значение имеют визуализация результатов исследования и возможность корректировки результатов; компьютеризация резко расширяет базу получаемых при анализе данных, при этом сохраняется возможность сравнения результатов; используемые материалы сравнительно дешевы.

Оставить комментарий

http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_bye.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_good.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_negative.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_scratch.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_wacko.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_yahoo.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_cool.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_heart.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_rose.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_smile.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_whistle3.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_yes.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_cry.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_mail.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_sad.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_unsure.gif 
http://alcoholismhls.ru/wp-content/plugins/wp-monalisa/icons/wpml_wink.gif 
 
Стопалкоголь-Элит
Восстанавливающие

Отзывы пациентов

Отзыв Николая: «Год назад я прошел сеанс по методу снятия подсознательных барьеров в центре В.А. Цыганкова. После этого сеанса весь год не пил, чувствовал себя хорошо. Сейчас пришел вновь, чтобы пройти такой же сеанс».

Отзыв Тамары: «Мне было очень плохо, и я не могла решить свою проблему с выпивками самостоятельно. Пришла на прием к Владимиру Анатольевичу Цыганкову и за один сеанс я почувствовала себя намного лучше. На душе стало спокойно, настроение улучшилось, нет тяги к алкоголю. Могу сама жить без спиртного и чувствовать радость от того, что способна управлять своей жизнью».

Отзыв Павла: «Поставил защиту от алкоголя полгода назад. Получил хорошее самочувствие, начал сбрасывать лишний вес, да и в семье все наладилось. Решил поставить защиту еще на год. Благодарю сотрудников центра Владимира Цыганкова за вниматеьное отношение и квалифицированную помощь!».

Отзыв Степана Тимофеевича: «Я пил почти каждый день долгие годы. Потом принял решение поставить защиту от алкоголя и не нуждаться в нем больше. Но для того, чтобы поставить защиту от алкоголя требовалось не пить семь дней, а я не мог уже и одного дня не пить. Помог мне «Стопалкоголь-Элит». Я стал пить отвар этого фитосбора и уже через несколько дней заметил, что заметно снизилась тяга к алкоголю, самочувствие стало лучше. Я сделал над собой небольшое усилие, не пил семь дней и записался на сеанс постановки защиты по методу снятия подсознательных барьеров в центр Владимира Анатольевича Цыганкова. После этого не пью уже 8 лет. Я очень благодарен В.А. Цыганкову. Дай Бог ему много лет жизни и хорошего здоровья!»

Отзыв Алексея: «Мне хочется выразить благодарность Владимиру Анатольевичу Цыганкову за то, что он помог мне остановить мое пьянство три года тому назад. Дай Вам Бог здоровья и долгих лет жизни, уважаемый Владимир Анатольевич! Мне помог «Стопалкогль-Элит» и восстанавливающие фитосборы».

Отзыв Татьяны: «Метод снятия подсознательных барьеров – замечательный. Жизнь кардинально изменилась в лучшую сторону, улучшилось психологическое состояние, абсолютно исчезла тяга к алкоголю. Прошла тревожность и депрессия. Чувствую себя здоровой. Искренне благодарю всех, кто мне в этом помог!».

Отзыв Михаила: «С благодарностью вспоминаю, как легко и комфортно прошел сеанс по методу безопасного кодирования. Спасибо за возвращение к нормальной жизни! Не пью уже 9 месяцев. Через три месяца приду к вам продлевать защиту от алкоголя еще на год. Благодарю персонал центра Владимира Цыганкова за доброжелательное отношение».

Отзыв Александра Ивановича: «Я пил более 20 лет. Никак не мог остановиться. Слишком сильной была тяга. Но 5 лет назад я смог все-таки бросить пить насовсем. Мне помогли фитосборы «Стопалкоголь-Элит» и «Восстанавливающие». Восстанавливающие сборы оказались особо полезными: восстановилась печень, восстановились почки. Даже врачи удивились. Теперь я к ним уже не хожу и таблетки не принимаю. Уже 5 лет живу трезво. Большое спасибо центру Владимира Цыганкова!»

Отзыв Веры: «Присоединяюсь к добрым отзывам о Владимире Анатольевиче Цыганкове. Я пила долго и много. Два года назад перенесла инфаркт. Именно тогда я пришла к Владимиру Анатольевичу Цыганкову и он поставил мне защиту от алкоголизма. Потом он научил меня управлять своими мыслями и чувствами, научил справляться со стрессами и страхами. Хожу в храм, а вместо алкоголя пью душистые, вкусные и полезные лекарственные травы. Я живу новой, счастливой жизнью».

Отзыв Станислава Михайловича: «Когда я впервые прошел сеанс по методу снятия подсознательных барьеров, то продержался без спиртного недолго - через 9 месяцев начал пить снова, хотя защита от алкоголя была на 1 год. Выпить уговорили друзья, сказали, мол, ничего страшного не произойдет, срок неупотребления уже подходит к концу. По глупости я послушался из выпил... и запои вновь вернулись. Я записался снова в центр Владимира Цыганкова на сеанс по методу снятия подсознательных барьеров. Мне поставили защиту от алкоголя сначала на 6 месяцев, в потом на 1 год. Полтора года уже не пью и чувствую себя прекрасно. Второй раз ошибки не совершу, никому не удастся уговорить меня выпить. Мне этого не хочется и не надо. И поэтому защиту от алкоголя продлю опять».

Отзывы наших пациентов смотрите здесь

Свежие комментарии
Поделитесь ссылкой!

Отзывы родственников наших пациентов

Отзыв Инны: «Мой муж пил три десятка лет. Как я ни пыталась его лечить, ничего не помогало. Когда я обратилась за помощью к Владимиру Анатольевичу Цыганкову, он мне открыл глаза на то, что я себя веду с мужем неправильно. Я поняла, что делать НЕ НАДО, а что делать НУЖНО. А вскоре и муж сам, без какого-либо давления с моей стороны бросил пить и начал лечиться. Благодарю Вас, Владимир Анатольевич! Вы заслуживаете самых добрых отзывов, и самых лучших отзывов заслуживает Ваша профессиональная помощь пьющим людям и их женам».

Отзыв Ирины Ивановны: «Мой сын был запойный, более 10 лет пьянствовал беспробудно. Что я только ни перепробовала, ничего не помогало его вылечить. Но однаждыя с помощью психолога Владимира Анатольевича Цыганкова отказалась от ненужных и неправильных действий, а стала делать то, что реально может замотивировать сына на прекращение пьянства и лечение. Дела пошли в гору. Сын сам пошел в центр Владимира Анатольевича, поставил защиту от алкоголя по методу снятия подсознательных барьеров. Теперь уже четыре года прошло, как он не пьет совсем. Теперь я понимаю, что роль матери бесконечно огромна в деле реальной помощи сыну».

Отзыв Дарьи: «Я благодарна психологам центра Владимира Цыганкова за то, что они помогли мне увидеть свою страшную болезнь – созависимость от пьющего мужа. Они дали мне мне возможность адекватно посмотреть на себя, на мужа, на нашу жизнь и сделать необходимые шаги для создания трезвой, здоровой семьи».

Отзывы родственников наших пациентов смотрите здесь

Рубрики сайта
Яндекс.Метрика